病理染色在疾病诊断及科研中至关重要，样本前处理的标准化直接关系到染色质量和结果的准确性。本文将对三种常见切片技术——固定组织冰冻切片、新鲜组织冰冻切片以及石蜡切片的前处理步骤进行详细解析，以供科研和临床参考。

一、固定组织冰冻切片

适用场景：需长期保存或特定抗原保存的样本。

步骤详解：

1. 固定：组织离体后立即浸入4%多聚甲醛或10%中性福尔马林，固定时间根据组织大小调整（通常为10-20分钟至24小时）。小样本适合短时间固定，而大块组织则需延长至24小时以确保蛋白结构完全凝固。

2. 梯度蔗糖脱水：固定后依次浸入15%及30%蔗糖溶液（PBS配制），每浓度静置过夜至组织沉底。蔗糖渗透脱水可以减少冰晶形成，维持细胞形态。

3. OCT包埋与切片：脱水后的组织置于冷冻切片机冷台，滴加OCT包埋剂完全覆盖，-20℃速冻10-20分钟。包埋后修块，调整切片厚度为8-10μm，贴片后在室温下晾干备用。

4. 后固定与通透：干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分钟，PBS冲洗后，以0.1% TritonX-100通透5分钟，增强抗体渗透。

二、新鲜组织冰冻切片

适用场景：术中快速病理诊断或保存脂类/酶活性。

步骤详解：

1. 速冻与包埋：新鲜组织离体后直接置于冰冻切片机冷台，滴加OCT包埋剂速冻10分钟。如需暂存，可液氮速冻后置于-80℃保存。

2. 切片与干燥：调整切片厚度为8-10μm，贴片后在室温下干燥30分钟，以确保切片紧密附着于载玻片。

3. 后固定与通透：干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分钟，PBS冲洗后，以0.1% TritonX-100通透5分钟，增强抗体渗透。

三、石蜡切片

适用场景：用于高分辨率组织结构观察及长期存档。

步骤详解：

1. 固定：组织切割为3-5mm薄块，用4%多聚甲醛固定12-24小时。大标本（如肿瘤）需延长至24小时以确保充分渗透。

2. 脱水与透明：使用梯度乙醇（70%→100%）逐级脱水，每级1-2小时；二甲苯透明2次（各15-30分钟），以便于石蜡的浸润。

3. 浸蜡与包埋：熔融石蜡（60℃）对组织浸泡2小时，包埋成块后置于4℃暂存，确保浸蜡彻底，避免切片碎裂。

4. 切片与烤片：切片机切取4μm薄片，并在65℃下烘烤1-2小时以增强附着力。烤片后进行二甲苯脱蜡（15分钟×2次），通过乙醇梯度水化至PBS。

关键注意事项

1. 固定时间：短于12小时可能导致固定不足，超过24小时或影响抗原表位。

2. 脱水梯度：乙醇或蔗糖浓度需严格递增，以避免组织收缩和变形。

3. OCT包埋：包埋剂应全面覆盖组织，避免气泡；切片方向需标示清晰。

4. 切片厚度：冰冻切片宜为8-10μm，石蜡切片应为4μm，过厚易导致脱片或染色不均。

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